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本产品是一种利用羟基自由基（·OH）特异性绿色荧光探针O27进行羟基自由基检测的试剂盒。O27可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的羟基自由基（·OH）氧化，产生绿色荧光产物。根据活细胞中绿色荧光的产生，可以判断细胞羟基自由基（·OH）含量的多少和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中羟基自由基（·OH）检测方法。

在激发波长488nm，发射波长525nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内羟基自由基（·OH）水平。

本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的羟基自由基的快速定性检测。通过荧光强度的大小来快速确定具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响细胞的羟自由基变化，羟自由基增加的样本荧光强度大。

• 长期不用-20℃避光保存，避免反复冻融，可以根据需要分装后冻存。
  
• 探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

• 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；
  
• 背景低，灵敏度高；
  
• 线性范围宽，使用方便。

• 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，激发波长488nm，发射波长525nm
  
• 离心机
  
• PBS缓冲液或者HBSS（无酚红）
  
• 荧光专用黑色96孔板

• 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
  
• 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
  
• 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
  
• O27探针在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。
  
• 对不同的细胞，应选择合适的孵育时间，以观察羟自由基的变化。
  
• 由于染色工作液稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
  
• 探针对湿度非常敏感，若是探针溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
  
• 羟基自由基（·OH）荧光探针O27母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
  
• 必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

• O27探针标记：
  
  • O27溶液可在新鲜无血清培养基、HBSS缓冲液、PBS缓冲盐溶液稀释到所需浓度，1000倍稀释，以此染色工作液更换细胞培养基；也可直接向细胞孵育液体中加入O27探针溶液至所需浓度。
    注：
    ● 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
    ● 开始实验前，使用HBSS缓冲液或无血清培养基稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过10倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度500～2000倍稀释，1000倍适合大多数细胞样本。
    ● 不能用含有血清的培养基稀释探针。
    ● 工作液现配现用。
    
  • 依据细胞羟自由基含量的不同，孵育时间可选择15～60分钟，在37℃或室温进行避光孵育。
    
  • 孵育结束后，用新鲜溶液清洗细胞。
    
  • 用相关仪器进行荧光检测。
    注：
    ● 荧光强，羟自由基强度高。
• 荧光显微镜检测：
  
  • 对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下染色观察；
    
  • 对悬浮生长细胞，染色后取25～50μL细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
    
  • 荧光显微镜检测。
• 流式细胞仪分析：
  
  • 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5～1mL冰冷PBS重悬细胞（5～10万）。
    
  • 采用488nm波长激发，测定525nm的发射，羟自由基强度高的细胞有较强的绿色荧光。

• 结果如何分析？
  通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其羟自由基的变化，测定其羟自由基是增加或者降低了。
  
• 荧光照片如何分析？
  需要有相关的荧光强度分析软件。羟自由基表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来提现。
  有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
  要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度，成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野的找。
  如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，做分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。
  为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。
  对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。要根据课题需要选择合适的测量统计方法。
  
• 荧光照片效果不好？
  荧光拍照存在很多变量，没一个变量都会严重影响拍照效果。
  荧光拍摄条件：拍摄环境、显微镜品牌和激发荧光决定了镜下观察的效果。同样的操作方法和切片，在不同品牌显微镜下显示出完全不同的荧光强度。
  荧光衰减：荧光物质的衰减通常哦度是非常明显的。同样的一组切片。1小时内拍摄和8小时后拍摄，荧光效果完全不同。
  最好用激光共聚焦显微镜，激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高得多，通常同一张片子激光共聚焦的效果明显更优。
  
• 背景荧光比较高？
  在没有细胞外酯酶和其他氧化酶的情况下，荧光随时间的逐渐增加可能是来自自发水解，导致水解的原因可能与大气氧化或光诱导氧化有关。
  
• 荧光强度在变化？
  可以观察到荧光的逐渐增加（由于自动氧化）货减少（由于细胞中的染料损失或光漂白）。在没有任何刺激或诱导的情况下，健康的未经处理的细胞中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。
  注意检测时平行操作即可。